實(shí)驗步驟:

1、插入撥片架上放入60-65℃C的烤箱中，烤片1-1.5小時。

2、脫蠟水化:二甲苯1，10min→二甲苯2,10min→二甲苯35min→無水乙醇1，5min一無水乙醇2，5min→95%乙醇5min→85%乙醇，5min→蒸餾水清洗。

3、抗原修復(fù):組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液(PH9.0)的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。中火至沸后斷電，間隔 10min中低火至沸，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片，(自然冷卻后將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。(修復(fù)液和修復(fù)條件根據(jù)組織來確定)

4、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶:切片放入3%H202溶液中,室溫避4、光孵育15min→切片在PBS(PH7.4)中脫色,床上晃動洗滌5min*3.

5、破細(xì)胞膜(僅核蛋白和部分胞漿蛋白):將Tritonx-100用PBS 稀釋至 0.5%后，適量滴加覆蓋組織，室溫孵育15分鐘后，切片用PBS溶液沖洗3次，每次5分鐘。

6、BSA 封閉:切片稍用干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止抗體流走)，在圈內(nèi)滴加用3%BSA或者山羊血清均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。

7、孵一抗:輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS/抗體稀釋液按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4C孵育過夜(淚盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))

8、孵 hrp 二抗:玻片置于 PBS(PH7.4)中洗3次，每次5min切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的hrp二抗覆蓋組織,避光室溫孵育 50min,PBs洗三次。

9、TSA熒光染料反應(yīng)液反應(yīng):濃縮型熒光染料與TSA buffer按照1:50-1:200的比例混合均勻，切片滴加配好的TSA英光染料反應(yīng)液均勻覆蓋組織室溫反應(yīng)1-15min(最佳時間5min-10min),PBS洗三次(預(yù)實(shí)驗可先染 1min洗干凈熒光染料后顯微鏡下觀察染色效果，如果陽性弱繼續(xù)滴加熒光染料加強(qiáng)染色強(qiáng)度直至合適強(qiáng)度后繼續(xù)進(jìn)行下一步)。

10、抗體洗脫:石蠟切片置于抗原修復(fù)液中95度水浴25-40min(根據(jù)不同抗體親和力，靈活調(diào)整時間)或者滴加適量37度預(yù)熱至完全溶解的mIHC專用抗體洗脫液(冰凍切片、爬片、骨組織建議用)覆蓋樣本，37度放置5-20分鐘，棄去洗脫液再次滴加適量抗體洗脫液覆蓋樣本 37 度放置5-20分鐘棄洗脫液，PBS洗三次，每次5分鐘。

11、重復(fù)4-8步驟(換另一種熒光染料第二輪標(biāo)記)

12、DAPI復(fù)染細(xì)胞核:玻片置于PBS(PH7.4)中洗3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育3/10min。

13、封片:玻片置于 PBS(PH7.4)中洗3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片(不含 DAPD)。

14、拍照:切片于倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。(紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長 420nm;FITC綠光激發(fā)波長465-495nm，發(fā)射波長515-555nm;CY3紅光激發(fā)波長510-560發(fā)射波長590nm)

注意事項：

樣品：

盡量選用新鮮制備的樣本；

確定樣品中抗原分子的表達(dá)豐度；

細(xì)胞/冰凍切片檢測胞內(nèi)蛋白或抗原表位在胞內(nèi)的膜蛋白需要進(jìn)行通透處理；

如果檢測抗原表位位于胞外段的是跨膜蛋白，則不需要進(jìn)行通透處理；

采用丙酮固定組織的切片，因丙酮本身具有通透作用，不需要額外的通透操作；

抗體：

選擇適用于免疫熒光的抗體；

通過實(shí)驗確定最佳稀釋比例；

選用二抗應(yīng)匹配一抗來源物種；

多指標(biāo)共染時，注意一抗必須來源不同物種；

共染時選擇二抗熒光峰值相差大的熒光標(biāo)記二抗以免串色；

操作步驟：

注意濕盒的保濕效果，避免樣品的干燥；

流水清洗切片時，不能直接對著切片沖，以免脫片；

細(xì)胞和冰凍切片比較脆弱，洗滌時轉(zhuǎn)速要溫和；

合理設(shè)置實(shí)驗對照組，排查抗體的特異性，以及是否存在自發(fā)熒光；

建議選用二抗種屬來源的動物血清作為封閉液；

從孵育二抗開始，注意避光操作，尤其是紫外光的照射，以免熒光淬滅導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

常見問題與建議：

1.背景太高：封閉不足；一抗?jié)舛冗^高，減少用量；設(shè)置無一抗對照，幫助確認(rèn)背景是否來源二抗，若二抗?jié)舛冗^高，減少用量。

2.熒光太弱：可能是由多種原因引起的，可以檢查曝光時間和強(qiáng)度；改變固定或孵育時間；確?？贵w/同型的兼容性；測試抗體稀釋范圍和樣品濃度；保證正確的試劑和載玻片的制備和儲存方法；檢查設(shè)備不兼容性。

3.非特異性染色：出現(xiàn)這樣的情況時我們可以檢查所用熒光團(tuán)的光譜是否重疊，即調(diào)整濾鏡和光源，更改為激發(fā)光譜或發(fā)射光譜沒有重疊的熒光團(tuán)；更換抗體；使用與二抗來源物種相同的血清作為封閉液；用針對一抗種屬的單價Fab片段封閉一抗，然后用二抗對單價Fab片段進(jìn)行可視化，可避免與樣本本身的Fc受體結(jié)合而引起非特異染色等排除干擾因素。

注意事項:

1.減少非特異熒光染色

細(xì)胞的活性和狀態(tài):流式細(xì)胞儀不但可探測細(xì)胞表面的熒光也可探測細(xì)胞內(nèi)的熒光。因此，如果要檢測細(xì)胞表面的分子一定要保證細(xì)胞的活性，還應(yīng)盡可能保持細(xì)胞靜止，通常在4度進(jìn)行操作。否則，熒光抗體進(jìn)入死細(xì)胞內(nèi)，會產(chǎn)生非特異結(jié)果。

2.封閉抗體的應(yīng)用是必不可少的，因為大多數(shù)的免疫細(xì)胞表面都表達(dá)有Fc-R。細(xì)胞與抗體相互作用后，一定要用FACS緩沖液洗2~3次，以除去游離的抗體。

3.單染色時以FACS最常用，F(xiàn)ITC標(biāo)記抗體熒光比較穩(wěn)定而且價格合適。

4.如果同時要檢測兩種以上的分子，一定要選擇不同波長的熒光所標(biāo)記的抗體。

文章出自：石蠟切片免疫熒光    想了解更多請關(guān)注：http://www.royallcapital.com/